Skip to content

Charcot-Marie-Tooth Disease Type 1A – Związek z spontaniczną mutacją punktową w genie PMP22 cd

2 miesiące ago

460 words

1A pokazuje sekwencje zestawów primerów 1, 2, 3 i 4, które zostały użyte do amplifikacji indywidualnych egzonów kodujących PMP22. Warunki PCR dla zestawów primerów 1, 3 i 4 były następujące: początkowa denaturacja w 94 ° C przez 2,5 minuty, a następnie 35 cykli składających się z denaturacji w 94 ° C przez minutę, hybrydyzacji w 60 ° C przez minutę, i wydłużanie w 72 ° C przez minutę i końcowy cykl wydłużania w 72 ° C przez 7 minut. Temperaturę wyżarzania 55 ° C zastosowano do zestawu starterów 2. W celu analizy heterodupleksu, 5 mikrolitrów produktów PCR pochodzących od poszczególnych członków rodziny i niecałkowitego kontrolnego mieszano, denaturowano w 95 ° C przez pięć minut i ochłodzono do 35 ° C. Zawsze stosowano kontrolę ujemną (10 mikrolitrów kontrolnego produktu PCR) 29. Dodano barwnik (2 mikrolitry) i próbki naniesiono na żel o grubości 1,0 mm, mierzący 21 na 40 cm (Bio-Rad, Richmond, CA) z akryloamidem wzmacniającym detekcję mutacji (AT Biochem, Malvern, Pa. ). Prążki wizualizowano bromkiem etydyny zgodnie z instrukcjami producenta.
Wzory do bezpośredniego oznaczania sekwencji nukleotydowej biotynylowanych produktów PCR wytworzono przez dwie rundy amplifikacji PCR. Pierwsza runda została przeprowadzona jak opisano dla każdego eksonu, a druga runda (15 cykli) wykorzystała 0,2 mikrolitra produktu PCR pierwszej rundy i starterów 0,1 mikromola, z jednym starterem biotynylowanym na końcu 5 . Szablony izolowano na kulkach streptawidynowych przez połączenie 20 mikrolitrów produktu PCR z 33,4 mikrolitrami Dynabeads (Dynal, Oslo, Norwegia) zgodnie z instrukcjami producenta. Kulki ponownie zawieszono w 20 mikrolitrach buforu TE (10 mM TRIS-HCl, pH 7,5, mM EDTA) i zastosowano 7 mikrolitrów w reakcjach sekwencjonowania dideoksy z zestawem Seąuenase 2.0 (US Biochemical, Cleveland) z użyciem znakowanego 35S trifosforan deoksyadenozyny.
Testowanie ojcostwa
Testy na ojcostwo przeprowadzono metodą Southern blot DNA z pacjentów 1, 2, 3 i 4 z użyciem sond pojedynczego locus D2S44, D4S139, D14S13 i D16S85, które zapewniły łączną średnią moc wyłączenia 99,93 procent.
Wyniki
Aby zidentyfikować pacjentów z CMT typu 1, którzy nie mieli duplikacji typu 1A, badano grupę niespokrewnionych pacjentów z CMT typu na obecność powielenia 1,5 Mb w 17p11.2-p12 za pomocą kilku niezależnych metod: pulsacyjnego pola elektroforeza żelowa do wykrywania fragmentu przyłączeniowego SacII o wielkości 500 kb swoistego dla duplikacji, analiza typu Southerna w celu zbadania różnic w dawkowaniu alleli polimorficznych wykrytych przez mapowanie sond w duplikacji oraz analiza polimorficznych alleli powtórzeń dinukleotydowych RM11-GT (trzy allele w obecność duplikacji), jak opisano wcześniej9. Badanie przesiewowe ponad 100 pacjentów z CMT ujawniło 32 pozornie niespokrewnionych pacjentów z CMT typu 1, którzy nie mieli powielenia CMT typu 1A (Wise CA, et al .: dane niepublikowane).
Rycina 2. Rycina 2. Rodowód rodziny (HOU226) z CMT typu 1. Dotknięci członkowie rodziny zostali zidentyfikowani na podstawie badania klinicznego i pomiarów prędkości przewodzenia nerwów ruchowych nerwów pośrodkowych i łokciowych
[przypisy: certus myślenice, cetaphil ps lipoaktywny, wodniste upławy ]

0 thoughts on “Charcot-Marie-Tooth Disease Type 1A – Związek z spontaniczną mutacją punktową w genie PMP22 cd”