Skip to content

Charcot-Marie-Tooth Disease Type 1A – Związek z spontaniczną mutacją punktową w genie PMP22 czesc 4

3 miesiące ago

485 words

Prędkości przewodzenia nerwów są pokazane dla wszystkich członków rodziny, z wyjątkiem Podmiotu 5, który był spokrewniony przez małżeństwo i który nie miał klinicznych objawów CMT. Powtórzono również allele powtórzeń dinukleotydu (GT) n w locus polimorficznym RM11-GT na VAW409 (locus D17S122) 9 i wymieniono je poniżej prędkości przewodzenia nerwów. Genotypy (GT) n oznaczono metodą PCR i oceniono na liczbę widocznych alleli9 (przy czym A równa się 163 bp, B 161 bp i C 155 bp). W oryginalnym raporcie z analizy RM11-GT zidentyfikowano siedem alleli o wielkości od 165 do 153 pz (AG); allel 163-bp pierwotnie oznaczono jako allel B, allel 161-bp jako C, a allel 155-bp jako F.9 Próbki DNA z tych 32 niepowiązanych pacjentów analizowano pod kątem mutacji w regionie kodującym kandydującego genu CMT PMP22. Badania struktury genowej ujawniły, że region kodujący PMP22 zawiera cztery eksony (dane niepublikowane), a startery flankujące zaprojektowano do amplifikacji PCR poszczególnych egzonów z genomowego DNA (Figura 1A). Odpowiadające produkty PCR od 32 niespokrewnionych pacjentów przeszukiwano pod kątem mutacji za pomocą analizy heterodupleksowej, w której produkty PCR od pacjentów i kontroli połączono w celu utworzenia dupleksów i niedopasowania zasad wykryto przez obecność dodatkowego pasma heterodupleksowego na żelach akryloamidowych o wysokiej rozdzielczości29. Jeden pacjent, Podmiot 7, został zidentyfikowany jako mający pozorną niedopasowanie zasad w kodowaniu egzonu 3 (Figura 1B). Analiza heteroprzeszczepu DNA z członków rodziny wykazała, że mutacja w trzecim eksonie kodującym PMP22 była segregowana za pomocą CMT typu (przedmioty 4, 6 i 7) (Figura 1B i Figura 2). Heterodupleksowa analiza eksonu 3 u 108 niespokrewnionych i nieobjętych kontrolą osób nie wykazała widocznego niedopasowania, co wskazuje, że mutacja PMP22 wykryta w badanej rodzinie jest specyficzna dla CMT typu i nie jest powszechnym polimorfizmem. Ponadto, Podmiot 4, którego rodzice nie byli dotknięci, miał nowy CMT typu 1, który pojawił się jednocześnie z pozornie spontaniczną mutacją w PMP22. Ściśle związany marker, RM11-GT, 9 mapujący w obrębie 50 kb PMP22,12 zastosowano do ustalenia ojcowskiego pochodzenia tej pozornie nowej mutacji (Figura 2). Wyniki typowania DNA były zgodne z ojcostwem, z prawdopodobieństwem 99,98 procent. Wystąpienie kliniczne CMT typu w rodowodzie było zatem związane z pozornie spontaniczną mutacją punktową pochodzenia ojcowskiego w PMP22.
Rysunek 3. Rysunek 3. Określanie sekwencji mutacji PMP22. Przeprowadzono bezpośrednie oznaczanie sekwencji biotynylowanych produktów PCR odpowiadających kodowaniu egzonu 3. W reakcjach PCR jeden ze starterów był biotynylowany na końcu 5 . Biotynylowane produkty PCR związano ze skoniugowanymi ze streptawidyną koralikami, zdenaturowano i przemyto; jednoniciowe biotynylowane produkty, które zostały zachowane, zastosowano jako wzorce do określania sekwencji DNA za pomocą standardowych reakcji końca łańcucha dideoksynukleotydowego. Sekwencje sensowne i antysensowne są pokazane dla nienaruszonego członka rodziny (Podmiot 1) i jego chorego syna (Podmiot 4). Umiejscowienie mutacji punktowej heterozygotycznej C-to-G jest wskazane na skórze sensownej (panel B) i antysensownej (panel D) dla podmiotu 4
[patrz też: charczenie u niemowlaka, druty kirschnera, certus myślenice ]

0 thoughts on “Charcot-Marie-Tooth Disease Type 1A – Związek z spontaniczną mutacją punktową w genie PMP22 czesc 4”